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DNA甲基化技術及其優劣勢比較
發布時間： 2023-11-14 點擊次數： 767次一、甲基化芯片
以Illumina的450K芯片為例，該芯片采用兩種分析：Infinium I和Infinium Ⅱ，前者有兩種bead（微珠），分別是甲基化M和非甲基化U，后者則是一種bead（不區分甲基化和非甲基化）。
如圖A：Infinium I，在未甲基化的GpC locus，U型bead尾部為A，與未甲基化CpG位點相匹配，能夠成功進行單核苷酸延伸并被檢測到（U型磁珠發光），而M型bead尾部為G，與未甲基化位點不能匹配，沒有信號產生；在甲基化的GpC locus，M型bead能與甲基化CpG位點相匹配，單核苷酸延伸并產生信號（M型磁珠發光），而U型bead則不匹配，不產生信號
如圖B：Infinium Ⅱ探針則不區分M和U，探針尾部為C，配對后只加入單個堿基（ddNTP-BioT， ddNTP-DNP），然后根據熒光顏色判斷加入堿基的類型，進而確定該位點是否被甲基化
探針長度為50bp，基于假設在50bp內的CpG位點具有相同的甲基化狀態，具有區域相關性
通過計算甲基化和非甲基化位點的熒光信號比例，可確定某位點的甲基化水平（Beta值=M/(M+UM)
二、WGBS
三、簡化亞硫酸氫鹽測序技術（RRBS）
RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing) ，即簡并代表性亞硫酸氫鹽測序技術。是一種用于基因組單核苷酸級別的甲基化水平分析的高效的高通量測序技術。這項技術結合了限制性內切酶和亞硫酸氫鹽測序，從而得到高CpG區域的富集信息。相比較全基因組甲基化測序技術，RRBS僅需要對基因組約1%的區域進行測序，因此費用大大降低。
技術流程
1. 酶切；2.末端補齊；3.測序文庫制備；4.純化；5.亞硫酸氫鹽轉化；6.PCR擴增；7.PCR純化；8.測序；9.測序數據比對與分析
甲基化芯片
優點：在全基因組尺度檢測，信息量大；在人中有效檢測和生物學時間相關區域的甲基化；
缺點：芯片雜交要求的設備昂貴；芯片限于人的樣本；只能覆蓋有限的CpG位點。
WGBS
優點：通量高 ，全基因組范圍；單堿基分辨率；
缺點：成本高，不適于大樣本研究分析；不適于特異位點、基因或區段研究。
RRBS
優點：在全基因組尺度檢測；分辨率達到CpG水平；不依賴限制性位點；樣本被精簡過，導致測序成本低；
缺點：雖然降低了成本，但價格仍然較高；對甲基化CpG覆蓋程度有限；目的不夠明確；基因組覆蓋不全容易遺漏一些關鍵的區間。
特異位點甲基化研究策略
一、甲基化敏感性限制性內切酶
優點：相對簡單,成本低廉，甲基化位點明確,實驗結果易解釋；
缺點：
1.由于CG不僅局限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；
2.只有檢測與轉錄相關的關鍵性位點的甲基化狀態時,該檢測方法的結果才有意義；
3.相對而言，Southern方法較復雜，且需要樣本的量大；
4.存在著酶不整體消化引起的假陽性的問題;
5.不適用于混合樣本；
6.雜交需要放射性標記；
7.覆蓋有限的CpG位點。
二、Bisulfite sequencing PCR (BSP)
基因組DNA經亞硫酸氫鹽處理后，設計BSP引物擴增目的片段，最后對PCR產物進行克隆并選取8-10個轉化子序列，即可確定所研究的CpG區域的甲基化頻率。
優點：可定性和定量檢測CpG位點甲基化狀態；片段有效長度較長；
缺點：通量低；成本高（測序成本和未轉化對照）；實驗周期較長；直接測序信號質量差，克隆測序操作繁瑣，不宜大批量操作。
三、Methylation specific PCR (MSP)
首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，然后針對甲基化和非甲基化引物進行PCR擴增，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態。
優點：靈敏度高，操作方便，經濟適用，節約時間；
缺點：只能定性，不可定量（半定量），特異性低；需要參考序列，引物設計非常重要；若待測DNA中5mC分布極不均衡，檢測結果較為復雜。
四、焦磷酸測序
五、飛行質譜法
優點：不依賴于限制性位點；分析片段比焦磷酸測序長200-600bp；檢測模板量低至20ng；可確定單一位點甲基化程度；靈敏度可低至5%；
缺點：引物設計有時候較難；硬件昂貴；實驗復雜、耗時，人為干預程度高，如PCR反應均應設空白對照和已知陽性對照，PCR產物轉移至質譜儀進行甲基化檢測時設置非甲基化樣本和甲基化樣本進行對照，需要操作規范，防止加樣交叉污染等才能確保結果真實性；經過2次處理，1次酶切，如處理和酶切不完整，則結果受影響較大。
六、MeDIP-chip/seq
MeDIP-chip
優點：在全基因組尺度檢測；不依賴限制性位點
缺點：抗體和微陣列需求的儀器昂貴；分辨率
MeDIP-seq
優點：在全基因組尺度檢測；分辨率達到CpG水平；不依賴限制性位點，覆蓋范圍廣；樣本被富集過，導致測序成本低；
缺點：抗體特異性要求高；測序成本高；對于區分甲基化區域來說，和同等方法相比不夠強大
靶向甲基化重測序
翼和策略：目標區間甲基化重測序（Hi-MethylSeq）
技術路線：
優勢：Hi-Methylseq結合了亞硫酸鹽轉換、靶向擴增子高通量測序技術，可實現多區段、多位點的甲基化精確定量分析。
應用：1、 適用于感興趣的目的片段的甲基化研究 ；
2、適用于在大樣本中進一步確認全基因組甲基化研究挑選的陽性位點。
文獻：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33
2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512
3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160
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