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對列樣本目標區域甲基化---WGBS后的正確打開方式
發布時間： 2024-05-27 點擊次數： 333次表觀遺傳學(epigenetics)是目前分子生物學研究的熱點之一，DNA甲基化是表觀遺傳學的重要內容，是基因組DNA的主要表觀遺傳修飾形式之一。DNA甲基化修飾對于維持正常細胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發育、衰老以及人類tumour發生，起著至關重要的作用。
全基因組甲基化研究方法主要有全基因組甲基化芯片、全基因組甲基化重測序(WGBS)和簡化亞硫酸氫鹽測序技術（RRBS），這些方法其實都有個共同的特點：信息量大，得到差異甲基化區域（DMR）非常多，但是價格昂貴，對個別區域覆蓋度和測序深度不足，可能會導致遺漏或假陽性結果。因此，對這些方法篩選出來DMR，需要做進一步的驗證，在隊列樣本中對目標區域進行甲基化檢測，并分析目標區域與疾病/性狀的關聯，才能進一步為疾病與該DMR的關聯提供流行病學的證據。
Hi-MethylSeq簡介
目標區域甲基化重測序（Hi-MethylSeq），又叫重亞硫酸鹽擴增子測序（Bisulfite Amplicon Sequencing，BSAS）。在前期全基因組甲基化測序、全基因組甲基化芯片等工作基礎上，或者依據文獻報道目的基因甲基化與性狀/疾病關聯，選擇感興趣的目的區間或候選基因，利用Hi-MethylSeq技術對大規模群體的候選基因甲基化水平進行檢測。
Hi-MethylSeq技術通過亞硫酸氫鹽（bisulfite）處理，用多重PCR擴增目的片段，添加barcode和測序通用接頭，在Illumina X10二代測序平臺對PCR產物進行高通量測序，利用生物信息學方法，精確定量計算目標區間內的甲基化位點的甲基化狀態，在完成目標區域檢測的同時大幅降低研究費用。
優勢及應用方向
1、優勢
Hi-Methylseq結合了亞硫酸鹽轉換、靶向擴增子高通量測序技術，可實現多區段、多位點的甲基化精確定量分析，特別適合隊列樣本目標區域的甲基化分析，測序深度高，結果更加準確。
2、應用
（1）適用于感興趣的目的片段甲基化研究 ；
（2）適用于在大樣本中進一步確認全基因組甲基化研究挑選的陽性位點（DMR）。
3、方向
農口：表觀遺傳學研究、品種鑒定、品種改良
醫口：tumour早期診斷、表觀遺傳學生物標志物開發、tumour復發的**預測因子
Hi-MethylSeq關鍵結果
結果對比
與標準方法結果一致，但更有優勢
Hi-MethylSeq與BSP結果一致，而Hi-MethylSeq在研究DNA甲基化時，每一個read 都相當于克隆測序時的一個單克隆，每個區段得到成千上百個reads,所以用二代測序比亞硫酸氫鹽修飾后的克隆測序技術得到的結果更加精確。
應用案例1
復發性妊娠丟失（RPL）是指妊娠24周前連續兩次或兩次以上的自然流產懷孕，占育齡夫婦的1%。表觀遺傳因素，包括某些基因表達DNA甲基化調控紊亂可能在RPL中起作用?？蒲腥藛T利用全基因組甲基化重測序和轉錄組測序聯合分析，鑒定蛻膜和血液中DNA甲基化調控的RPL相關基因，并使用翼和生物Hi-MethylSeq進行case和control組的關鍵基因DMR甲基化檢測。終發現，SGK1和CREB5的異常甲基化可能是神經系統失調的原因之一，這些基因位于子宮內膜，可能是導致生殖失敗的原因之一。SGK3在生殖系統中的作用值得進一步調查。
應用案例2
研究人員使用全基因組甲基化芯片聯合生物信息學方法來鑒定自身性免疫性疾病GD的差異甲基化區（DMR），通過構建DMR注釋基因的蛋白互作網絡（PPI）篩選出關鍵節點基因（Hub Gene）。利用翼和生物Hi-MetylSeq技術分析了關鍵節點基因的DMR區域，結果發現CDKN2C、SERPINA1、IRS4，尤其是B3GNT2是潛在的與GD相關的異常甲基化基因。這些發現可能是GD疾病中的DNA甲基化的近報道。
綜上所述，全基因組甲基化測序分析獲得DMR后，需要在隊列樣本中進行驗證，翼和Hi-MethylSeq技術是WGBS后續驗證的有力工具。
主要參考文獻：Cai et al. Identifying and validating differentially methylated regions in newly diagnosed patients with Graves' Disease. DNA and Cell Biology 2021, 40(3):1-9.
Zhou et al. Genome wide methylation analysis to uncover genes related to recurrent pregnancy loss. Genes & Genomics 2021, 43(4):361-369.
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主營產品：主要技術服務：細胞STR鑒定；支原體檢測；細胞種屬檢測；端粒長度檢測；端粒酶活性檢測等。
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