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高靈敏度支原體檢測
發布時間： 2024-05-29 點擊次數： 425次支原體(Mycoplasma)：目前發現的最小原核生物，據統計約15~35% 的細胞被支原體污染。支原體污染會改變宿主細胞的結構與功能，易致實驗結果不穩定，須對培養細胞定期進行支原體檢測。
本試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針法) 檢測支原體DNA。檢測對象為細胞培養的上清液，細胞沉淀或其他生物制品。該試劑盒具有以下特點：
靈敏：配合推薦使用的核酸抽提方案，檢測靈敏度達到10CFU/ml。
可靠：抽提加入內標核酸，全過程質量控制。
穩定：全程閉管操作，無交叉污染。
方便：操作簡單，無需電泳步驟。
表1 產品組分
注：
1、陽性質控含有支原體DNA和內標DNA。
2、內部質控含有內標DNA。
在實驗前請完整閱讀本說明書，務必重視注意事項和無菌操作規范！
【操作步驟】
1.樣本制備
（1）樣本的標準制備方案：請配合使用高效無微生物污染的DNA抽提試劑盒提取樣本DNA。整個過程需要遵守無菌操作規范。本公司目前推薦抽提試劑盒見附錄3。直接取20 µL待測樣本DNA，作為模板進行 qPCR 反應。
（2）前處理陰性樣本準備方案：將RNase Free Water當成樣本，加入內部質控，進行核酸抽提。
2. qPCR 反應液的準備
（1）根據所要檢測樣品的數量，計算所需反應孔數，每個樣本做3個重復孔。
反應孔數=1個陽性PCR質控+1個陰性PCR質控+1個前處理陰性質控+樣本數× 3
（2）根據反應孔數計算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：
Mix =（反應孔數+1）×10 μl
（3）各試劑放室溫融化，并根據下表所示準備 qPCR Mix：
表2 qPCR Mix的配制
3. 加樣
（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。
（2）向每孔反應管中分裝 10 μL qPCR Mix。
（3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應管中加入15 ul石蠟油。
（4）向反應管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：
表 3 加樣示例
【注】：此時每個反應孔的體積為30μL。
qPCR 陰性的PCR模板為20 ul RNase Free Water。
PCR 儀設置以 ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇TaqMan 探針法：
注：1、該程序為兩階段擴增法，如熒光定量PCR儀可以兩階段收集熒光，按照正常Ct值判斷結果；如果只能最后一步收集熒光，需要在原數據的基礎上加15個Ct值。
2、ROX設置是以7500為例，但也存在例外，例如StepOne。
【閾值設置】
以ABI 7500 為例，擴增曲線選擇 log 法，如果不能兩階段收集熒光，基線設置1~2個循環；如果可以，基線設置3-15個循環。建議用 log 法擴增曲線保證結果穩定可靠。
（1） 內參(HEX/VIC)閾值設定：以陽性對照定內參擴增曲線閾值，將內參的Ct 值定為 28±2。
（2）支原體(FAM)閾值設定：以陽性對照定支原體擴增曲線閾值，將支原體(FAM)的 Ct 值定為 28±2 。
【實驗質量控制】
如果陽性對照管的支原體(FAM)Ct 值>30，但陽性對照管及前處理陰性對照管的內參(HEX)Ct 值正常，表明陽性支原體對照模板有降解。
如果樣品前處理陰性的內參（HEX/VIC)Ct 值>30，陽性對照管的內參(HEX)Ct 值>30 ，表明內參DNA存在降解或PCR體系擴增效率下降。
【結果判讀】
根據支原體(FAM) Ct 值、內標(VIC) Ct 值判定，具體標準如下：
要求每個檢測樣品做3重復，如果3復孔中，兩重復為陽性，則判讀為陽性；建議做樣本前處理陰性，可以質控整個抽提過程。
注：檢測結果異常時：
1. 樣品前處理陰性：內參Ct值過大，表明抽提效率低；支原體檢測通道Ct值小于37.5，可能前處理抽提過程存在污染。
2. qPCR陰性：支原體和內參檢測通道Ct值小于37.5，操作過程存在污染。
3. 樣本前處理陰性質控和PCR陽性質控內參差1±1個Ct值屬于正?，F象。
【PCR過程注意事項】
由于 PCR 反應非常靈敏，實驗操作中應注意以下事項，以免發生DNA 污染：
1．試劑盒開啟后，陽性質控和內部質控與試劑Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蠟油分開存放。
2．每個組分在使用前都應先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。
3．要求核酸抽提和qPCR過程都符合無菌操作規范。
4．建議自備轉運盒，用于將配制分裝好的Mix從配置Mix超凈工作臺轉運到加樣超凈工作臺。
5．建議在 qPCR 反應板上陽性對照的排布應遠離待測樣本和陰性對照。
6．建議 qPCR 配置與分裝在一個無菌操作臺，樣本的加樣在另外一個無菌操作臺。
7．建議使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進行加樣。
8．應按照先加陰性，再加樣本，最后加陽性的順序加樣。且陽性用專門的加樣器。建議陽性在專門的無菌操作臺加樣。
9．qPCR 反應板封膜或蓋蓋子時須反復壓緊。
10．上機擴增前，反應管短時低速離心，將管壁液體收集至管底
11．蓋上反應管蓋子或者貼上光學膜后，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標記，或者用刮板反復摩擦。
12．本產品僅作科研用途。
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主營產品：主要技術服務：細胞STR鑒定；支原體檢測；細胞種屬檢測；端粒長度檢測；端粒酶活性檢測等。
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